基于固態(tài)激光器的簡單易用的單箱相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡，省去了兩臺要求高度同步的摻鈦藍寶石激光器。 Heinz P. Huber，Sandra Zoppel，Ingo Rimke 在過去的十年間，基于非線性光學(xué)效應(yīng)的多光子顯微技術(shù)在提高顯微成像對比度和分辨率方面日益得到重視。通過增加照明光源的強度，這些非線性效應(yīng)提高了圖像的橫向和縱向分辨率，實現(xiàn)了微尺度范圍內(nèi)的三維成像。在諸多多光子成像技術(shù)中，雙光子激發(fā)熒光顯微鏡被廣為采用，每年至少要安裝幾百套基于該技術(shù)的系統(tǒng)。[1]雙光子成像使用同時吸收兩個光子的辦法來激發(fā)一個染料分子，其目的是獲得跟激發(fā)波長相比具有藍移的熒光。 可調(diào)諧飛秒激光被用作雙光子激發(fā)的光源。通過共焦顯微鏡，熒光信號可以很容易地從激發(fā)背景中探測到，在現(xiàn)代生命科學(xué)中利用特定的染料分子，幾乎可以看到所有的生理過程。 然而，雙光子熒光顯微鏡的最大缺點是使用染料來成像，因為它們的毒性會改變機體內(nèi)的生理過程。熒光蛋白質(zhì)（如綠熒光蛋白）經(jīng)常被用來代替染料，但是這種方法涉及復(fù)雜的基因樣本復(fù)制技術(shù)。此外，這些染料在數(shù)分鐘內(nèi)被漂白的特性，將使熒光信號逐漸減弱。 基于非線性光學(xué)效應(yīng)的一些方法被用于克服與染料相關(guān)的問題，這些效應(yīng)包括二次或三次諧波產(chǎn)生（SHG或THG）、拉曼散射，或是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。CARS是一個涉及四個光子的三階非線性效應(yīng)（X(3)過程）。 在CARS過程中，頻率為ωp的泵浦光和頻率為ωs的斯托克斯光把樣品激發(fā)到一個虛態(tài)（virtual state），并產(chǎn)生頻率為ωp-ωs的分子振動。如果ωp-ωs等于分子的特征拉曼頻率Ω，這種振動激發(fā)就會非常有效。通過三階非線性過程產(chǎn)生的頻率為ωas = (ωp-ωs) + ωp的反斯托克斯邊帶是最終的測量信號（見圖1）。通過主動驅(qū)動振蕩和相干作用，CARS信號會遠遠高于普通的拉曼散射。 圖1：在CARS方案中，泵浦脈沖（ωp）和斯托克斯脈沖（ωs）產(chǎn)生了信號頻率（ωas）。使用CARS進行成像可以獲得相同的對比度而不需要使用染料，產(chǎn)生較強的頻率為ωas的藍移信號，可以很容易地從激發(fā)背景中區(qū)分和探測（見圖2）。CARS信號對樣品的振動模敏感，可以對活體內(nèi)的分子振動密度成像。 圖2：CARS顯微鏡捕獲的線蟲（上圖）和活酵母細胞（下圖）展示了高對比度和較高的圖像質(zhì)量，這也證明了這種技術(shù)的可行性。在線蟲圖像里，可以清楚地看到腸道和受精卵。腸道中血脂在2845cm-1產(chǎn)生很強的CARS信號（積分時間為5s）。活酵母細胞在2845cm-1共振處被記錄（積分時間是1s）。兩幅圖的尺寸都是150×150